酶聯免疫吸附實驗用于標記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性，在室溫下穩定反應產物易于顯現，能商品化生產。如今應用較多的有辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應用*。
酶聯免疫吸附實驗檢測抗原的方法有以下三點：
1、雙抗體夾心法
屬于非競爭結合，檢測抗原常用的方法，檢測含有至少兩個抗原決定簇的多價抗原。原理是先將特異性抗體與固相載體連接;加入待測標本，形成固相抗原抗體復合物;再加入酶標抗體形成雙抗體夾心，洗滌;加底物顯色，根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量檢測。
2、雙位點一步法
針對抗原分子上兩個不同且空間距離較遠的決定簇，包被使用一種單抗，酶標記使用另一種單抗。測定時將待測抗原和酶標抗體同時加入，溫育、洗滌，加入底物顯色。若待測抗原濃度過高時，過量的抗原可分別同固相抗體和酶標抗體結合而抑制夾心復合物的形成，出現鉤狀效應，顯色降低，甚至假陰性。必要時可將標本經過適當稀釋后重復測定。
3、競爭法
用于測定小分子抗原，如藥物、激素等。原理為先用抗小分子的特異性抗體包被固相，然后同時加入待測樣本和酶標記的小分子，兩種小分子競爭與固相上的抗小分子的特異性抗體結合，溫育一定時間后洗滌，加入酶底物顯色。
特點：
①酶標記抗原與樣品或標準品中的非標記抗原具有相同的與固相抗體結合的能力；
②反應體系中，固相抗體和酶標抗原是固定*，且前者的結合位點少于酶標記和非標記抗原的分子數量和；
③免疫反應后，結合于固相載體上復合物中被測定的酶標抗原的量(酶活性)與樣品或標準品中非標記抗原的濃度成反比。
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